染色体制备技术是细胞遗传学研究的基础手段，高质量的染色体中期分裂相，是研究物种亲缘关系、遗传结构、倍性及细胞周期等的前提。随着现代分子生物学的飞速发展，不断涌现出诸如分子标记技术、原位杂交技术，尤其是荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)的突飞猛进，再次突显出染色体制备的重要性。贝类种类繁多，迄今为止，有记载的有约有十一万五千种，其中化石种类约占了三万五千种，成为动物界仅次于节肢动物的第二大门类(蔡英亚和谢绍河, 2006)。回顾细胞遗传学的发展历史，关于软体动物的染色体研究也有近百年历史。但发展至今，关于贝类染色体的报道却很少，并不是人们对贝类不感兴趣，主要原因是贝类染色体较小，染色体制片技术很难有新的突破。近年来，随着研究方法和手段的不断改进，贝类染色体制备已能达到令人满意的效果。

贝类染色体的制备材料，大多采用成体的鳃组织或早期胚胎(Komaru and Wada, 1985; 阎冰等, 1999)，也有报道使用外套膜、触手及肾细胞(沈亦平等, 1993; 李雅娟等, 2002; 杨品红等, 2008)。选材的原则是细胞分裂旺盛、易获取较多中期分裂相，其中以胚胎为材料获取的分裂相最为理想，但该方法受繁殖季节的限制，不能随时获取胚胎。以成体鳃组织为材料虽无季节限制，但由于贝类细胞分裂缓慢，获取的分裂相相对较少。因此，迫切需要找寻一种方法，能更好解决上述矛盾。

本研究以牡蛎和珍珠贝为材料，分别采取不同的手段进行预处理，后采用常规的细胞空气干燥法进行染色体制备，均获得了较多中期分裂相，其中尤以植物血球凝聚素(phytohaemagglutinin, PHA)处理法制备染色体标本及PHA促进贝类繁殖获取胚胎法制备染色体标本的效果最佳。值得一提的是，将PHA应用于贝类染色体制备，发现PHA不仅具有加速细胞分裂的能力，同时PHA也是优秀的催产剂，可方便地诱导产卵。

1材料和方法
1.1材料
牡蛎(Crassostrea sp.)、咬齿牡蛎(Saccostrea mordax)采自海南三亚西岛码头。随机挑选雌雄个体各3只用于成体染色体制片，暂养于实验室水槽内。牡蛎及咬齿牡蛎经广东海洋大学蔡英亚教授鉴定。

马氏珠母贝(Pinctada martensii)以及企鹅珍珠贝(Pteria penguin)由海南陵水黎安港的海南毅珠水产养殖场提供。挑选性腺成熟雌雄个体若干，促其繁殖并获取一定数量担轮幼虫用于染色体制片。

1.2成体染色体制片
以成体鳃组织为材料进行染色体制片，为提高分裂相数目，预处理方法有如下3种：PHA处理法，将贝暂养于含0.01% PHA的海水中24 h，后置于含0.005%秋水仙素的海水中处理8 h，取鳃进行染色体制片；低温同步化法，将贝暂养于8℃的海水中半月左右，转入常温海水中，投喂扁藻，饲养数日，后置于含0.005%秋水仙素的海水中处理8 h，取鳃进行染色体制片；活体去壳法，小心剥去贝的较扁平一侧外壳，向围心腔处注射0.005%秋水仙素，处理8 h后取鳃进行染色体制片。在处理过程中保持内脏团湿润。活体取鳃，在过滤海水中漂洗两次，放入0.075% KCl低渗液中剪碎，冰浴低渗30 min，离心，弃上清。缓慢加入新配的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，冰浴固定20 min，离心，弃上清，重复3次。在预热56℃温片上悬空滴片，空气干燥。10% Giemsa扣染30 min，空气干燥，镜检，统计分裂相数目。

1.3胚胎制片
将性腺成熟的贝浸泡于含0.01% PHA的海水中，促其繁殖，受精后，待胚胎发育至担轮幼虫阶段，将幼虫转入含0.005%秋水仙素的海水中处理6 h，取幼虫进行染色体制片。

用800目筛绢浓缩幼虫，转移至0.075% KCl低渗液中，冰浴低渗30 min，离心，弃上清。加入新配卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，冰浴固定20 min，离心，弃上清，重复3次。加入解离液(冰醋酸:水=1:1)，解离细胞，在预热56℃温片上悬空滴片，空气干燥。10%Giemsa扣染30 min，空气干燥，镜检，统计分裂相的数目。

2结果与分析
2.1三种成体制片法效果比较
由表1可见，在PHA处理法中，12 h内几乎没有作用，处理24 h分裂相最多，为3.50‰，继续延长处理时间效果基本相同，60 h后，分裂相数目有下降趋势。低温同步化法，48 h内获得的分裂相很少，随着暂养时间的延长，分裂相逐渐增多，在72 h时分裂相达到最多，为2.20‰，尔后出现下降趋势，但分裂相数目最大时的比例仍远小于PHA处理法所获得的数目。活体去壳法，因为除去外壳后，直接注射秋水仙素，不存在预处理，除非出现死亡情况，分裂相总量一直保持在较高水平，为3.10‰~3.60‰，但随着受伤机体的衰竭，细胞将迅速停止分裂。

表1 不同时间和不同处理后牡蛎的染色体分裂相比例 Table 1 Ratio of metaphase after different periods with methods in Crassostrea sp.

 2.2采用不同组织材料制片获取中期分裂相的比较
 由表1可见，采用成体鳃组织制片获取分裂相的比例最大值为3.60‰，而采用单轮幼虫制片获取分裂相的比例均在10.00‰以上。无论采用成体鳃组织还是胚胎进行制片都能得到令人满意的分裂相(图1)。

图1 四种贝类染色体的中期分裂相 Figure 1 The metaphase of four bivalvia

3讨论
 以成体鳃组织为材料制备染色体标本是目前贝类细胞遗传学研究的主要手段，已在蚶、蛤、牡蛎等多种双壳贝类研究中取得了成功(陆荣茂等, 2008; 潘英和苏以鹏, 2007; Wang et al., 2004)。以鳃组织为材料制备染色体标本，往往易受到贝类细胞分裂缓慢的限制，PHA能够很好的解决这个问题。在鱼类的染色体研究中，PHA处理法作为一种成熟的技术，很早就用于鱼类染色体标本的制作(林义浩, 1982)，而在贝类染色体研究中，最近几年才见到报道(王金星等, 1998)。本研究将PHA应用于成体鳃组织染色体制片，对不同处理时间进行统计，24 h分裂相最多，为3.50‰，分裂相比例为低温同步化法的1.6倍，处理时间缩短了48 h。PHA可以促进血细胞分裂，但对其他类型的细胞是否有类似作用的报道尚未见到。贝类特殊的开管式循环系统使得鳃组织中含有丰富的血细胞，因此推测采用该方法获取的中期分裂相，很大程度上来自于血细胞。

活体去壳注射法在本研究中也取得了较好的效果，分裂相数目(3.20‰~3.60‰)、处理时间均与PHA处理法基本相同。贝类组织受伤后，机体在恢复的过程中，细胞分裂速度必然加快，此时用秋水仙素加以处理，可获取大量中期细胞。但该方法操作困难，在剔除外壳时易导致贝类死亡，并且在处理过程中必须保持内脏团湿润。

贾志良等(2001)采用低温同步化法24~72 h获得中期分裂相数目相同均为0.65‰，72 h后出现下降趋势。在本研究中，采用低温同步化法在72 h获得中期分裂相数目为2.20‰，但72 h同样出现下降趋势。人为在短时间内改变环境温度，利用低温诱导细胞分裂的同时，严重影响了贝类的正常代谢活动，机体机能逐渐衰竭，在低温处理的前12 h内，出现大量死亡个体，即使能够存活下来的实验贝，闭壳肌收缩也非常迟缓，这也正解释了72 h后出现分裂相数目下滑的原因。低温同步化法虽然能够获得一定数量的中期分裂相，但预处理时间长，温度不易控制，易导致大量贝类死亡，甚至实验贝全部死亡，就分裂相数量上看，也远不如PHA处理法的效果好。

 采用胚胎进行染色体制片，逐渐成为目前染色体制片的趋势(Bouilly et al., 2008)，胚胎具有数量多、易收集、分裂旺盛等特点，能够获取大量中期分裂相。本研究采用单轮幼虫制片获取分裂相的比例均在10.00‰以上，是所有处理方案中获取分裂相数目最多的一种。但贝类繁殖具有季节性，目前掌握的贝类人工繁殖技术并适用于所有贝类，诸多因素都制约了胚胎制片技术的发展。

 综上所述，由于贝类繁殖受季节性影响，要想随时获取高质量的染色体标本，即使是在贝类生长迟缓的7~10月份，依然可以通过PHA处理法来实现。研究还发现，PHA不仅能够加速细胞分裂，还能够加速性腺成熟的贝类繁殖，较常规的阴干法或臭氧刺激法等更容易快速、大量收获胚胎，这也为胚胎染色体制备找到一条更好的途径。

参考文献
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